色谱分析技术:高压液相色谱

        一、分类
??高效液相色谱可分为四种基本类型：液固色谱、键合相色谱、离子交换色谱和尺寸排阻色谱。
?? (1) 液固色谱
??液固色谱法通常称为吸附色谱法。吸附剂包括活性炭、氧化铝和硅胶。液固色谱中使用的载体是硅胶。硅胶对溶质和分子的吸附能力不是均匀分布在整个硅表面。硅胶表面有一些区域会与溶质分子发生强烈的相互作用。这些区域是活动场所。硅胶与溶质分子之间的主要相互作用是偶极力氢。键和静电相互作用。极性越强，化合物在硅胶柱上的停留时间越长。在液固色谱中，流动相溶剂分子和溶质分子竞争固定彼此的活性位置，从而使溶质从色谱柱中洗脱下来。与硅胶表面活性位点结合力强的溶剂，对溶质分子的洗脱能力很强，故称为强溶剂，反之亦然。液固色谱的特点是适用于色谱几何异构体的分离，可用于脂溶性化合物，如磷脂、类固醇、脂溶性维生素、前列腺素等。
?? (2) 键合相色谱
??键合相色谱是从液-液相色谱发展而来的，即分配色谱。键合相色谱法将固定相与载体颗粒共价结合，克服了流动相在流动相通过色谱柱时流动中的溶解和机械冲击的问题。性质逐渐变化等缺点。键合相色谱可分为正相色谱和反相色谱。
??正相色谱
??在正相色谱中，与载体共价结合的基团都是极性基团，如伯氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相非常相似的非极性溶剂，如庚烷、己烷、异辛烷等。由于固定相是极性的，流动溶剂的极性越强，洗脱能力越强，即极性越大的溶剂是强溶剂。固定相与流动相的关系与液固色谱法*相同，称为正相色谱法。然而，正相色谱的分离原理主要是基于化合物在固定相和流动相中的分配系数不同，不适用于几何异构体的分离。
?? 2. 反相色谱
??在反相色谱中，与载体共价结合的固定相是一些直链烃，例如正辛基。流动相的极性强于固定相的极性。反相色谱在高效液相色谱中应用最为广泛。在反相色谱中，溶质保留的主要功能是疏水性，在高效液相色谱中也称为疏溶剂性。所谓疏水相互作用是指当水中存在非极性溶质时，溶质分子之间的相互作用，溶质分子与水分子之间的相互作用远小于水分子之间的相互作用，因此溶质分子被“挤压"从水中。出来了可见，反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出，而且在色谱柱中的保留时间也长，因此反相色谱中不同的化合物根据其疏水性进行分离特性。反相色谱适用于分离具有不同疏水基团的化合物，即具有非极性基团的化合物。此外，反相色谱可用于分离具有不同极性基团的化合物。可以改变溶剂及其组成和流动相的 pH 值来影响溶质分子与流动相的相互作用并改变它们的保留行为。此外，反相色谱流动相中水的比例非常灵活，可以/从0-100%，因此反相色谱可用于水溶性和脂溶性化合物的分离.反相色谱中的固定相是线性饱和的烷烃，它们与硅胶载体共价结合。它们的链长不同。最长的是十八烷基，它也是zui常用的固定相。线性饱和烷烃的疏水性随着烃链的长度增加而增加，由于疏水作用，溶质在反相色谱柱中的保留时间也会随着烃链的长度增加而增加。一般来说，这意味着具有烃链长度的反相色谱柱可以获得更好的分辨率。在大多数情况下，它是依靠重复选择列。由于反相色谱的固定相是疏水性烃，溶质与固定相之间的作用主要是非极性相互作用，或疏水相互作用，因此溶剂的强度随着极性的降低而增加。水是反相色谱中极性*的溶剂，也是最弱的溶剂。在反相色谱中，常使用碱性溶剂，并在其中加入不同浓度的可与水混溶的有机溶剂，以获得不同强度的流动相。这些有机溶剂称为改性剂。反相色谱中zui常用的有机溶剂是甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氢呋喃、异丙醇和二恶烷也常用作改性剂。
??在生化分析中，反相色谱应用极为广泛。可用于①氨基酸和多肽的分析； ②蛋白质的分离； ③碱基、核酸和核酸酶的分析； ④甾体化合物物质分析； ⑤与其他酚胺、组胺、糖类和维生素的分离。
?? (3)离子交换层析
??离子交换色谱中的固定相是一些带电基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中还有其他带相反电荷的离子，根据质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。当固定相基团带正电时，可交换离子为阴离子，该离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电，能与流动相交换的离子是阳离子。离子交换剂称为阳离子交换剂。阴离子交换柱的官能团主要是-NH2和-MH3+：阳离子交换柱的官能团主要是-SO3H和-COOH。其中-NH3+离子交换柱和-SO3H离子交换剂是强离子交换剂，在较宽的pH范围内具有离子交换能力； -NH2和-COOH离子交换柱是弱离子交换剂，只有在一定范围内才有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，如氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离，蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。
??二、容易出问题
??(1)涡流扩散
??当流动相遇到较大的固体颗粒时，会像流水打石头一样产生涡流。如果柱子装填不均匀，有些零件松动或有小凹槽，流动相的速度会很快；如果某些零件结块或包装紧密，则流动会很慢。腰带变宽了。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，柱子的填料要紧密均匀，这样涡流扩散小，柱效高。
?? (2) 分子扩散
??分子扩散是物质分子从高浓度区向低浓度区的运动，也称为纵向分子扩散。为了减少分子扩散，使用小而均匀的固体颗粒填充色谱柱。同时，在操作过程中，如果流速过慢，被分离的物料停留时间长，扩散会很严重。
?? (3) 传质
??被分离的物质必须在流动相和固定相中平衡，这样才能形成一个狭窄的区域。在液相色谱中，溶质分子在两个液相之间分离。制备或吸附和解吸在固相上需要一定的时间。流速快时，传递速度慢，在达到平衡动态相前向前移动。这些物质的非平衡运动使区域变宽。
?? (4) 移动相流量
??当流速过低时，分子扩散严重，尤其是在气相色谱中。例如，如果将理论塔板高度与流速作图，则理论塔板高度随着流速的增加而迅速降低。当达到最小值时，随着流速的增加，传质将起主要作用，理论塔板高度再次增加。在高效液相色谱中，较快的流速影响不大，但在凝胶过滤色谱中，由于物质必须渗透到凝胶内部，传质影响很大，流速会降低柱效.
?? (5) 固定相颗粒大小
??固定相颗粒越小，柱效越高，流动相流动阻力越大。必须增加压力才能使其流动。